MICROSCOPIO DE LUZ.
Antecedentes históricos. Los primeros
aparatos elaborados con lentes de
aumento se utilizaron para la visión lejana, Galileo Galilei a principios del
siglo 17 en 1609 se adentro en el espacio exterior con el telescopio, dando un
nuevo significado al papel del hombre en el universo. Este investigador
fundador del método experimental comprendió que el mismo aparato podía ser
usado para analizar objetos pequeños y algunos de sus contemporáneos intentaron
utilizarlo para este fin. La inagotable curiosidad humana se enfocó hacia la
estructura del mundo visible microscópico que le rodeaba. Esta investigación
requirió de la creación de un instrumento capaz de penetrar en la compleja
arquitectura del apasionante mundo microscópico que existe mas allá de nuestra
visión normal. La
palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de
la "Accademia dei Lincei" una sociedad científica a la que
pertenecía Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observación
microscópica del aspecto de una abeja. Según los italianos el microscopio se invento
hacia 1612 por Galileo.
Según los holandeses el
primer microscopio surgió de las hábiles manos del tallador holandés de lentes Hans
Janssen y de su hijo Zacarías, en el año de 1590. Este y otros
microscopios similares de aquellos tiempos estaban formados por dos lentes
convexas sobrepuestas en elementos de enfoque rudimentarios. Entre los
microscopios construidos en ese tiempo, está el que diseñó un comerciante en
telas, holandés, llamado Anton Van Leewenhoek, en 1632; con ese
instrumento observo agua estancada de charcos, gotas de sangre y otros
materiales orgánicos e hizo detalladas descripciones, algunas de las cuales aún
sorprenden por su exactitud.
Otros investigadores de ese
siglo 17 que hicieron valiosos descubrimientos con estos microscopios
rudimentarios, fueron Marcelo Malpighi (1628-1694) fundador de la
histología, quien descubrió parte de la estructura microscópica del riñón y
de la piel, describe los capilares sanguíneos y publica en 1660 y 1665; Robert
Hooke, quien en 1665 examinando una rebanada muy delgada de corcho utilizó
por primera vez en la historia el término de "Célula" en su
obra Micrografhia. Bichat a fines de 1700 introduce el concepto de tejido,
describiendo 21. Mayer en 1819 describe el concepto de Histología.
Sin embargo el trabajo
fundamental sobre la moderna teoría celular, de que todos los tejidos animales
como vegetales están constituidos por agrupaciones de células, no se llevó a
cabo hasta principios del siglo 20. En 1833 Brown describe al núcleo.
En 1838, el botánico alemán Matthias Schleiden anunció que la célula era
la unidad estructural de toda materia vegetal y un año después su
compatriota Teodhor Schwann afirmó que "las células son organismos
y que los animales y plantas completos son agregados de dichos
organismos, dispuestos con arreglos a determinadas leyes". Remak en
1852 establece que las células derivan de otras células y 3 años mas tarde Virchow
lo confirma con su tesis omnis cellula e cellula. El alumno de Henle,
Koelliker en 1852 organiza los tejidos de Bichat en los cuatro
fundamentales actuales, además de ubicar al espermatozoide como una célula,
que posteriormente en 1876 Hertwig demuestra que es el responsable de la
fecundación
El microscopio en algunas
épocas (siglo 18) constituyó solamente un entretenimiento de salón entre las
clases acomodadas, y no fue sino hasta mediados del siglo 19, cuando gracias al
perfeccionamiento de las lentes y a la invención del condensador por Ernest
Abbe, se pudieron lograr imágenes sin distorsión y de mayores aumentos,
llegando lograr hasta 500 x aumentos en la observación; en 1877 publica su
teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopia de
inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener
aumentos de 2000x A principios del presenta siglo los avances técnicos en la
fabricación de lentes permitieron que
el microscopio alcanzara el máximo aumento y nitidez que se pueden lograr de acuerdo
a las características físicas de la luz.
El uso del microscopio no se limita a discernir el aspecto morfológico
micrométrico de los organismos vivientes, también se usa como apoyo para
determinar cantidad y localización de componentes moleculares diversos, como
grasas, proteínas, carbohidratos, minerales, vitaminas, etc., utilizado métodos
histoquímicos enzimáticos, no enzimáticos e inmunoquímicos con
fluorescencia. Asimismo en ocasiones es necesario examinar el aspecto
tridimensional de los especimenes vivos o fijados mediante el uso del
microscopio Estereoscópico.
Aunque casi siempre lo que se observa son preparados teñidos
artificialmente, las técnicas microscópicas de Contraste de Fases, de
Interferencia y de Campo Obscuro, permiten ver células sin tinción alguna. Esto
ha hecho posible ver células o tejidos vivos cultivados artificialmente sin
tinción o también con los llamados colorantes supravitales, como el
carmín y azul tripán (fagocitosis), rojo neutro (leucocitos), verde jano
(mitocondrias) y la alizarina (matriz ósea).
El máximo aumento del
microscopio de luz tiene limitaciones físicas hasta 1,500 veces; alrededor de 1930 se ideó utilizar un haz de
electrones en lugar de la luz visible. Con esta idea al aparato concebido se le
llamo microscopio electrónico de transmisión (MET), consiguiendo aumentos de 100.000 X, el límite teórico
de aumentos del microscopio puede llegar a mas de un millón de diámetros. Fue
desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. El microscopio Trabaja
“iluminando”, un ejemplar en la platina con un haz de electrones, enfocando y
aumentando la “imagen” con lentes magnéticas. Esta imagen electrónica, que es
invisible, se transforma en una imagen normal, visible mediante una pantalla
especial.
Con este microscopio se han podido ver y descubrir las estructuras mas
finas y pequeñas de los seres orgánicos y elementos inorgánicos, llegando
incluso a observar la estructura molecular.
Posteriormente, en 1942
se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM) o Scanning. El microscopio electrónico de barrido (MEB)
sirve para examinar la superficie de los objetos. Produce imágenes de gran
aumento (más de cien mil veces) y muestra la forma real de los objetos. Además
de mostrar increíbles figuras, el microscopio electrónico investigador muestra
detalles que pueden ser de vital importancia para científicos en muchas áreas,
como la medicina. Trabaja examinando la superficie de un objeto con un delgado
haz electrónico.
Microscopio cuántico: El microscopio cuántico es un microscopio que
forma parte de los instrumentos llamados nanoscopios porque posibilitan
“ver” objetos del tamaño en nanómetros y aún menores, se conoce como
"microscopio de barrido de efecto túnel" (STM) y fue presentado en
1982 por Binning y Röhrer. Ambos recibieron por esto el Premio Nóbel de
Física en 1986.
El microscopio de
luz (ML), está constituido por tres sistemas:
1. El óptico.
2. El de iluminación, y
3. El mecánico.
SISTEMA ÓPTICO.
El sistema óptico está
formado por dos juegos de lentes:
a) El ocular, que es la lente en contacto con el ojo del
observador y que generalmente aumenta de 8 a 20 veces el tamaño de la imagen
lograda por el objetivo, pero no aumenta la resolución.
b) El objetivo, es la lente próxima al objeto o espécimen,
están colocados en la parte inferior del
tubo insertados en una pieza metálica, denominada revolver, que permite
cambiarlos fácilmente generan una imagen real, invertida y aumentada.
Tenemos
varios tipos de objetivos: los panorámicos, de pequeña longitud, los hay
de 2.5 x, 3.5 x, 4 x y 6 x o aumentos, con apertura numérica de 0.08. El seco
débil nos da 10 aumentos y tiene AN de 0.25,
el seco fuerte produce 40 x (AN = 0.65), y el de inmersión (AN =
1.25); llevan dibujado un anillo de
color que indica el número de aumentos:
Pardo = 2.5 x
Rojo = 4 x.
Anaranjado = 6.3
Amarillo = 10 x.
Verde claro = 16 x.
Verde obscuro = 25 x.
Azul claro = 40 x
Blanco = 100 x.
Este último que es retráctil
es el llamado de inmersión ya que para su utilización se necesita
utilizar aceite de cedro sobre la preparación, para disminuir el índice de
refracción y lograr mayor nitidez de la imagen a estos aumentos. Los más
frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos,
Cada uno de los objetivos del
microscopio presenta una serie de números o letras grabadas sobre el
cilindro metálico que aloja las lentes, vg:
40/0.65; 160/0.17, cuyo significado es:
En algunos casos,
los datos correspondientes a la distancia de viaje de la luz y el espesor del
cubre objetos no se consignan. Cuando no existe la 3, indica que el objetivo
tiene corrección al infinito. Cuando no aparece la 4, significa que el espesor
del cubre objetos no es factor crítico.
Plan: plan acromático, esto
es objetivo acromático con imagen plana.
Neofluar: objetivo con
apertura incrementada, mejor reproducción de los colores, con elevado contraste,
pero sin imagen plana.
Los
objetivos de inmersión traen según el material que usen, los grabados
siguientes:
Oel: aceite (IR 1.515)
W: agua (IR 1.333)
Glyz: glicerina (IR 1.455)
Multiplicando los
aumentos del ocular por los del objetivo se puede tener el aumento real del ML.
Por ejemplo: si el ocular es de 10x y el objetivo de 40x, se obtendrá un
aumento de 400 veces el tamaño de los objetos observados. Este aumento se
denomina diámetro y se designa con la letra "x".
Los sistemas ópticos tienen
un límite físico de amplificación determinado por el poder o límite de
resolución, que es la capacidad para distinguir dos puntos cercanos en el
campo como entidades separadas. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2
mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a
esa distancia.
Teóricamente la máxima
resolución que se puede alcanzar en los sistemas ópticos es de 0,2 micras dada
por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde.
Este límite o poder de
resolución está expresado por la siguiente fórmula:
L.R.= K x L sobre A.N.
Donde Kappa es una constante calculada en 0.61 y Lambda
es la longitud de onda de la luz empleada. Generalmente se toma la longitud de
onda de la luz verde-amarilla que es de 0.55 micras. La apertura numérica
"A.N." es igual al menor índice de refracción (N) interpuesto entre
el corte y el objetivo multiplicado por el seno de la mitad del ángulo de
abertura (Â).
(A.N. = 1/2 SEN Â x N.)
Esquema (e) que
muestra el cono luminoso que penetra en un objetivo. Se indica la mitad del
ángulo de abertura (Â) que interviene en el cálculo de la abertura
numérica.
SISTEMA DE ILUMINACIÓN.
El sistema de iluminación tiene por objeto hacer pasar un
haz intenso y condensado de luz a través del espécimen y de las lentes, para
obtener una imagen clara y nítida. Este sistema está formado por:
a) Una fuente
luminosa incorporada a la base del microscopio, cuya intensidad puede graduarse
con una perilla que se encuentra a un lado.
b) Un condensador de
los rayos divergentes de la fuente de luz, colocado por debajo del espécimen,
para proporcionar un haz luminoso intenso y homogéneo que ilumine uniformemente
el objeto que se observa. Tiene incorporado un diafragma de iris que elimina
los rayos periféricos.
SISTEMA MECÁNICO.
El sistema mecánico
está constituido por:
a) Una base que da apoyo al microscopio y contiene la fuente
luminosa.
b) Un brazo que da apoyo a la platina y al revolver y contiene en
ambos costado los tornillos de enfoque grueso y fino.
c) Una platina, que es una placa con una perforación central que
tiene incorporada en su parte inferior al condensador. Se desplaza
verticalmente por los tornillos de enfoque grueso y fino. Tiene un carro
móvil que sujeta o fija al objeto y que puede desplazarse en todas las
direcciones del plano horizontal por medio de un juego de tornillos. Los que
carecen de carro móvil, cuentan con un par de pinzas sobre la platina para
sujetar el objeto o laminilla.
d) Un tornillo macrométrico para desplazamiento grueso de la
platina y enfoque rápido del objeto.
e) Un tornillo micrométrico para desplazamiento lento de la
platina y enfoque fino del objeto.
f) Un disco giratorio (revolver) con topes fijos, al cual van
atornillados los objetivos.
g) Una base para los oculares, con una inclinación adecuada para
la observación cómoda.
Consejos para el trabajo de observación y cuidado del microscopio.
Otros
tipos de microscopios
Microscopio de contraste
de fase – Permite observar células
sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las
distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido.
La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una
deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz
que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio
de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la
amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un
contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden
a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para
observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
Dos modificaciones del
microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio
de interferencia diferencial.
Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz dispersa o
refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de
campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra
con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa como un
fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la
muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz
emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz
reflejada por las partículas de polvo que llegan hasta la retina del ojo y las
hacen visibles.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de
campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo
puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo
oscuro, debido al contraste creado.
Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar
espiroquetas, en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la
sífilis.
Microscopio de
fluorescencia – Una molécula que
fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro
visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Se usa para
revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A y algunos
neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas autofluorecentes su aplicación
más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección
de antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración inmunocitoquímica.
También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o
directamente en células y usarlas como marcadores. Estos métodos sirvieron para
estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en
neurobiología y en detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en
tejidos mineralizados.
Se insertan distintos
filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir luz
monocromática o casi monocromática, o entre el espécimen y el objetivo
permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue
hasta el ojo o incida en una emulación fotográfica u otro procedimiento
analítico.
Microscopio de barrido
confocal – Se usa para estudiar la
estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de iluminación con
rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de
barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo
fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un sistema de espejos para
mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez.
Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo
móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un
monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar
imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se
restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la
imagen.
Es posible también crear
imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar
reconstrucciones tridimensionales.
Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz
ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la
muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm,
por lo tanto puede alcanzar una resolución de 0,1 um. La microscopia
ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotómetro
pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede
observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede
dañar la retina.
El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen
determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la
iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar
el DNA y el RNA de cada célula.
Microscopio de polarización – Este microscopio es una simple
modificación del microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado
polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo
polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador.
Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos
de rotación se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz
de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de
rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia.
Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones
cristaloides de las células intersticiales testiculares.
Microscopia electrónica
Dentro de los microscopios
electrónicos tenemos el de barrido y el de transmisión.
La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los ópticos esta en que la
longitud de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la
resolución.
Microscopio electrónico de transmisión – La óptica es muy similar al óptico
pero se diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz
visible.
Este microscopio se basa en
los siguientes principios:
- Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (cátodo)
Un ánodo, hacia el cual son
atraídos los electrones
Una diferencia de potencial
entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de aceleración entre 20.000 y
200.000 voltios a los electrones, que crea la haz
El haz pasa por una serie de
electroimanes que tienen las mismas funciones que las lentes de vidrio de un
microscopio óptico
El condensador forma el haz
y modifica el diámetro del haz que incide en el plano del espécimen. El haz que
atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio de un objetivo y
se aumenta aun más con una o más lentes proyectoras. La imagen final se
visualiza sobre una planilla cubierta por fósforo. Las porciones de la muestra
que han sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones
que absorbieron o esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido
al agregado de metales pesados durante la preparación del espécimen aparecen
oscuras. Se coloca una placa fotográfica o un detector de video por encima o
por debajo de la pantalla del visor, con la finalidad de obtener un registro
permanente de la imagen sobre la pantalla.
Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio óptico pero
requieren métodos más finos.
Los preparados la restricción que tienen es que en cada paso se trabaja con
especimenes de magnitud 3-4 órdenes menores o más finos que los utilizados para
el microscopio óptico. Debido a la gran resolución de estos microscopios
electrónicos la calidad de la fijación, es decir el grado de preservación de la
estructura subcelular debe ser la mejor posible.
La preparación de rutina de los especimenes para la microscopia electrónica de
transmisión comienza con la fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado
con un buffer y de una fijación con tetraóxido de osmio.
Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico de transmisión piezas
de tejido no mayores de 1 mm3
El proceso de deshidratación
es idéntico al empleado en la microscopia óptica
El tejido incluido en material plástico se secciona por medio de micrótomos
especialmente diseñados, que usan cuchillas de diamante o vidrio.
Debido al limitado poder de penetración de los electrones, el espesor de los
cortes preparados para el microscopio electrónico de transmisión varia entre 50 nm y 150 nm. Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se
los hace flotar desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja
llena de líquido, se recuperan y se colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas
por plástico. Estas rejillas tienen 50-400 orificios por pulgada o hendiduras
especiales para observar cortes seriados.
Por lo general, la coloración de los cortes para microscopio electrónico de
transmisión se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de
elevada densidad, tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales
pesados se unen a los tejidos durante la fijación o la deshidratación o al
sumergir las muestras en soluciones de tales iones después del corte. El tetraóxido
de osmio que se emplea de rutina en el fijador se une a los componentes
fosfolipídicos de las membranas, lo cual agrega densidad a la membrana.
A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohólicas usadas en la
deshidratación, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones
celulares y a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de acetato de
uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para teñir los cortes antes de
observarlos con microscopio electrónico de transmisión.
La congelación-fractura es un método especial de preparación de la muestra para
microscopia electrónica de transmisión, de gran importancia en el estudio de
membranas.
El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el
fijador del tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el
tejido con un crioprotector, como el glicerol y se congela rápidamente a unos
–160 grados centígrados.
Microscopio electrónico de barrido – Se asemeja más que al microscopio
electrónico de transmisión a los tubos de televisión de donde deriva la
microscopia electrónica. Para analizar la mayoría de los tejidos se deja la
muestra, se deshidrata por desecación de punto crítico, se cubre con una
película evaporada de oro-carbón, se monta en un taco de aluminio y se coloca
en la cámara de muestras del microscopio. En los tejidos mineralizados es
posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejía y analizar las
características estructurales del mineral.
Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de
electrones a través de la superficie un tubo de televisión. Los electrones
reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de
la superficie son captados por uno o más detectores y reprocesados para formar
una imagen tridimensional en un televisión.
Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen en una cinta
de video. Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde
la superficie, la catodoluminiscencia de las moléculas del tejido por debajo de
la superficie y los electrones de Auger emitidos en la superficie.
Muchos microscopios combinan las características de un microscopio electrónico
de transmisión y de barrido, el cual permite microanálisis por rayos X con
sonda electrónica.
Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos
cuando el haz de electrones bombardea el corte histológico, y mediante
analizadores apropiados se construye un mapa que muestra la distribución en los
cortes de los elementos que tienen número atómico mayor de 12, en concentración
suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se puedan analizar.